黑曲霉液体发酵桔粉产纤维素酶的研究

摘要：以桔粉为原料，以黑曲霉(Aspergillus niged为发酵菌株， 采用液体发酵法生产纤维素酶。通过 单因素试验考查了麸皮和蛋白胨的比例(CN 、装液量及接种量3个因素对产酶的影响，并在此基础上, . 通过正交试验确定了发酵产酶的工艺条件为:添加桔粉80g/L,麸皮和蛋白胨质量比1:2.250mL三角 瓶装30mL Mandels氏营养液、接种量3mL，于30C下培养72h,纤维素酶产量达到1885.71U/go

 关键词桔粉: 黑曲霉:液体发酵:纤维素酶

 

纤维素酶是具有降解含有β-1,4糖苷键的纤 维素的一组酶的总称，广泛应用于酿造果汁与蔬 菜加工、粮食加工、饲料、造纸、中草药有效成 t 分的提取、纺织、采油工程、废水处理以及能源 制造等各个方面。我国是柑桔生产大国，每年都 会产生很大- -部分落果和滞销果，这部分废弃柑 桔一般都是直接扔弃，既浪费了资源，又污染了 环境。. 柑桔富含果胶、纤维素、可溶性糖及多种维 生素和矿物元素，是一种良好的微生物生长基质。黑曲霉是公认安全(CRAS 的微生物，用 其生产酶制剂安全、可靠，不产生毒素，而且生 长快、发酵周期短，具有明显的优越性。利用黑 曲霉液体发酵柑桔产纤维素酶目前未见报道。本 文通过黑曲霉液体发酵桔粉产纤维素酶的研究， 旨在为纤维素酶的液体发酵生产提数据参考，也 为废弃柑桔的综合利用开辟新的途径。

材料与方法

 1.1 材料

 桔子落果，本地桔园获得，无腐烂，将其烘 干磨成粉末，备用。 黑曲霉(Aspergilus nge) :

本院微生物试验室保藏。

 

1.2 培养基 

1.3.1 营养液 Mandels氏营养液。

 1.3.2 斜面培养基. PDA培养基:马铃薯(去皮200g, 葡萄糖 5g, KHPOlg水1000mL，自然pH，琼脂5go 1.3.3发酵 产酶培养基 产纤维素酶基础培养基:柑桔粉80g/L，其 他组分按照单因素试验方案进行配置，pH 6.5。 摇瓶发酵培养基:将培养好的新鲜产孢子斜 面.上的孢子制备成孢子悬液，按培养基体积10% (约1.2*10*个孢子)接种到产纤维素酶基础培养 基中，于30 C、200r/ min振荡培养72 h。 1.4 主要试剂

.二硝基水杨酸(DNS 试剂:取酒石酸 钾钠182g,溶于500 mL蒸馏水中，加热。于热溶 液中依次加入-二硝基水杨酸6.3g,氢氧化 钠10g，苯酚5g，无水亚硫酸钠5 g搅拌至溶 解，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL，混匀，过 滤，贮于棕色试剂瓶中，于暗处放置72 h后使用。

 柠檬酸缓冲液(pH 4.8，0.05 mol/D:取 40mL 0.lmol/L 柠檬酸与60 mL 0.1 mol/L柠檬 酸三钠混合，再加200 mL蒸馏水稀释- -倍。

1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 溶液:称取. 1 g羧甲基纤维素钠，精确至1 mg， 缓缓加入pH 为4.8的柠檬酸缓冲液80 mL,水浴加热至全部溶 解。

搅拌均匀，冷却后定容至1000mL,再用二层 纱布过滤。此溶液在4 C冰箱贮存，有效期为3d。 1g/100mg葡萄糖标准贮备溶液:称取预先 于(103士 D C下干燥至恒重的葡萄糖1.000 g, . 用蒸馏水溶解后定容至100mL,即为1g/100 mL浓度的葡萄糖标准溶液。

1.5 方法 1.5.1 纤维素酶活力测定 采用DNS法。 1.5.2 葡萄糖标准曲线的制作 分别配制0μg/mL、200μg/ mL、400 g/ mL、 600μg/mL、800μg/ mL、1 000μug/ mL、1 200μg/ mL 标准葡萄糖使用溶液，各吸取0.50 mL于试管中， 同时分别吸取柠檬酸缓冲液1.5 mL、DNS试剂 3.0mL于上述试管中，混匀。将试管置于沸水浴 中，反应7 min，取出，迅速冷却至室温，准确 加入蒸馏水10mL,混匀。用10mm比色杯，以 空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计 1=540nm处测吸光度。以葡蔔糖质量浓度为横坐 标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线 性回归方程。相关系数R2应在0.9990以上时方 可使用(否则须重做)。

 

2结果与讨论 2.1 葡萄糖标准曲线 按1.5.2中的方法绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程: D 0) =0.000 2ρ+ 0.0402，R=0.999 6。 标准曲线见图1。

由图1可知，相关系数R2为0.9996，大于 0.9990，说明回归方程拟合良好，因此可以使用 该葡萄糖标准曲线。

 2.2麸皮和蛋白胨的质量比 CMD对产酶的影响 将麸皮(辅助碳源与蛋白胨 (氮源按不 同质量比混合成同质量浓度(6 g/ mL固形物 的培养基。取30 mL Mandels 氏营养液于250 mL 三角瓶中，做7次试验，加入麸皮与蛋白胨不同 质量比的混合物，分别为0:6、1:5、 1:2、 1:1、 2:1. 5: 1. 6:0，然后置于30 C下振荡培养. 72 h,收获后测定酶活力。麸皮与蛋白胨的质量 比对纤维素酶产量的影响见表1。

2.3装液 量对产酶的影响 

在250 mL的三角瓶中分别加入20 mL、30 mL、 40mL、50mL、60mL的Mandels氏营养液(发酵 液)，按80g/ L加入桔粉、按6g/ 100 mL加入 麸皮及蛋白胨组成培养基，并接入等量的孢子， 置于30 C下振荡培养72 h，收获后测定酶活力。 不同装液量对黑曲霉产纤维素酶的影响见图2。

 

图2表明，装液量30 mL黑曲霉产纤维素酶 的产量最高。由30mL至60mL来看，随着装液 量的增加，酶活力减少，说明黑曲霉的生长和产 酶的多少都与通气量有很大关系:装液量为20 mL 时酶活力比装液量为60mL时的要高，这是因为 发酵培养过程中-直处于恒温状态，会导致部分 失水，所以对发酵过程造成一定的影响。因此最 佳装液量选择30 mL。

 2.4 接种量对产酶的影响 

分别在装好桔粉和麸皮蛋白胨混合物的250 mL 三角瓶中加入30 mL Mandels 氏营养液，再分别 接入1.5mL、3mL、4.5 mL、6mL、7.5 mL种子 液，然后置于30 C下振荡培养，进行发酵培养. 72 h,收获后测定酶比活力。接种量对产酶的影 响如图3所示。

由图3可知，当接种量为Mandels氏营养液 体积的10%时，黑曲霉的产酶量最高:接种量大 于15%时，酶活力开始下降。这说明在一定的环 境条件下，底物量- -定时，微生物种群达到- - 定 数量将会对其本身产生抑制作用，对其生长和产 酶都有- -定程度的不利影响，故选择10%接种量 为佳(即接种量为3 mD。 2.5发酵培养 基优化正交试验 在单因專 美治甄產電的研究基础上，以发 无识别结果 醇培养基的裁皮和金白胨质量比、装液量及接种量3因素作为影响黑曲霉发酵生产纤维素酶的主 要的因子，设计3因素3水平的正交试验，采用 L,(39表，因素水平设计见表2,试验结果见表3。

极差分析表明， 各因素对产酶影响的主次顺 序为: A>C>B, 最优水平为ACB，即麸皮和蛋 白胨质量比为1 : 2,接种量为3 mL,装液量为30 mL。此方案在正交试验范围内，此条件下所 得酶活力为1 885.71 U/go 

3结论

 以黑曲霉为试验材料，采用液体发酵法，考 察发酵桔粉产纤维素酶的培养条件。结果表明: 添加柑桔粉80g/L、麸皮和蛋白胨质量比为1 :2 (6 g/ 100 g固形物D、250 mL三角瓶装30 mL Mandels氏营养液、接种量3 mL,于30 C下培养 72 h,纤维素酶产量达到最高。研究表明，黑曲 霉可作为纤维素酶生产的优良菌种。

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