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鸡蛋白提取液对体外培养干细胞蛋白的影响(生物科学论文)
2022-1-7

鸡蛋白提取液对体外培养干细胞蛋白的影响(生物科学论文) 

搞要 摘要:发现一种提取液能促进体细胞向干细胞转变将在再生医学研究中 有重要的意义,下 面是小编搜集整理的一.篇探究鸡蛋白提取液对体外培养千 细胞蛋白影响的论文范文,欢迎阅读参考。有文献报道动物的卵细胞提取液 能重新编程体细胞,包括猪的卵细胞1和非洲爪蟾的

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 发现一种提取液能促进体细胞向干细胞转变将在再生医学研究中有重要 的意义,下面是小编搜集整理的一篇探究鸡蛋白提取液对体外培养千细胞蛋 白影响的论文范文,欢迎阅读参考。 有文献报道动物的卵细胞提取液能重新编程体细胞,包括猪的卵细胞[1 ]和非洲爪蟾的卵细胞

[2, 3]提取液都能使体细胞核重编程。在这个研究中, 我们用鸡蛋白提取液作用于不同细胞,共培养3d后,收集细胞,送公司做干 细胞蛋白芯片检测,现将研究报道如下。

1材料与方法 细胞来源 

4种细胞为我们实验室经常培养的细胞,C57小鼠的骨髓间充质干细胞(C 57-BMSC) (自己制备),树駒的脐带间充质干细胞(TS-UC- MSC) (自己制备), 293T细胞(购上海科拉曼有限公司)和GFP慢病毒转染成 功的293T细胞(293T-GFP) (自己转染成功)

 鸡卵清提取液的制备 取几个鸡卵,无菌分离卵清和卵黄,卵清按1 : 1加裂解液,充分搅匀, . 存放于- 20C。冻融3次后,离心,取上清,4C保存。裂解液配方: 50mmol/LNaCl, 5 mmol/LMgCl2, 100mmol/LHEPES, , 1mmol/L二硫苏糖醇(DTT), /L苯甲基磺酰氟( PMSF)和蛋白酶抑制剂。由此得到的提取液为鸡卵清提取液。获得的提取液 用50%的终浓度与293T细胞共培养3d,然后用定量PCR的方法检测细胞多能基 因0CT4和NANOG与对照(培养基培养)相比明显升高,即为质控指标合格,可 用于下面的实验。

 

干细胞蛋白芯片检测步骤 

 

      每个芯片孔中加入100μ l的1×封闭液,室温摇床上孵育30min, 避免产生气泡;抽去封闭液,每个孔中添加100μ1样品, 一个阵列一个样 品;4C振荡过夜孵育。使用ThermoSci entificWel lwashVersa芯片洗板机清 洗玻片,每孔加入70μ 1生物素标记抗体;室温震荡孵育1^ 2h, 清洗,每孔 加入70μ1的1500倍稀释的荧光剂- 链霉亲和素,用密封条贴住玻片,然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育 12h.清洗,采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号。采用芯片分析软件 提取数据,对于Foldchange,选取大于为有统计学意义。

 

检测多能标志

 

    蛋白0CT4和NANOG兔抗人0CT4多克隆抗体购自Immunoa- way公司,鼠抗人NANOG单克隆抗体购自Millipore公司,二抗均购自碧云天 生物技术有限公司。293T细胞在6孔板中,一孔加培养基,一孔加50%终 浓度 的鸡蛋白提取液,共培养3d后,用碧云天的IP细胞裂解液提细胞蛋白,取50 μ l细胞蛋白液加10μ l6×的上样缓冲液,100C 水浴5min,上样20 μl,进行SDS- PAGE电泳,电泳结束后,100v电压转膜 1h,膜用5%脱脂奶粉的TBS封闭37°C1h , 将一抗1 : 250稀释于2%脱脂奶粉的TBS中,37"C振摇1h, TTBS洗3次, 每次5m in,二抗1 : 200稀释于2%脱脂奶粉的TBS中,37C振摇1h, TTBS洗3次,每次5m in, ECL显色,用Tanon的化学发光成像仪检测发光条带。

 2结果 

      有3个蛋白发生了统计学意义的改变S0X17、BMPR- 1A和NANOG是干细胞中表达的蛋白,当体细胞向干细胞转变后细胞中这几个 蛋白的表达升高,我们用50%终浓度的鸡蛋白提取液与C57-BMSC共培养3d后,这几个蛋白的表达明显升高,说明C57- BMSC又向更多能的干细胞分化了,见图1.

有1个蛋白发生了统计学意义的改变BMPR- 1A是干细胞多能性的标志,TS-UC- MSC用50%鸡蛋白提取液共培养3d后,与未加鸡蛋白提取液培养的细胞相比, BMPR-1A明显升高,说明细胞又向多能干细胞的方向分化了,见图2. 有1个蛋白发生了统计学意义的改变BMPR- 1A是干细胞多能性的标志,293T细 胞是标准的体细胞株,用50%鸡蛋白提取 液共培养3d后,BMPR- 1A表达明显升高,说明293T细胞有向干细胞转变的现象发生,

见图3.

 有1个蛋白发生了统计学意义的改变0CT4是千细胞多能性的标志,293T- GFP用50%的鸡蛋白提取液共培养后,对比培养基培养的细胞0CT4的表达明显 增加,说明细胞有向干细胞转化的现象。 细胞0CT4和NANOG蛋白的Westernblot结果(图5)0CT4和NANOG蛋白是干细 胞多能性的标志,293T细胞用50%的鸡蛋白提取液共培养后,0CT4和NANOG蛋 白的表达量明显增加(图5和表1),与对照组(培养基培养)相比有统计学意义( P<, n=3)

3讨论

 S0X17、BMPR- 1A、NAN0G和0CT4是 千细胞中表达的蛋白,在细胞转化为多能的干细胞时, 这几个蛋白的表达明显升高。因此,这些蛋白在细胞中表达明显升高时,可 以认为细胞向多能的干细胞发生了转化。我们用共培养法发现加了50%鸡蛋 白提取液的细胞有- -些千细胞蛋白表达明显升高, O无识别结果胞提取液诱 导体细胞核重编程的方法,通常用可逆渗透法,即先用链球菌溶血素0(SL0)在细胞膜上打孔,再用卵细胞提取液渗透,最后再用氯化钙再封合细胞膜上 的孔,是否这种方法诱导效率更高,需要今后的实验进- - -步深入研究。

 

我们在实验中用了4种细胞,C57 小鼠的骨髓间充质干细胞(C57- BMSC)、树駒的脐带间充质干细胞(TS-UC- MSC)、293T细 胞(购自中国科学院昆明细胞库)和GFP慢病毒转染成功的293T 细胞(293T- GFP),用50%的鸡蛋白提取液共培养3d后,均检测到了干细胞相关蛋白表达的 升高,说明了鸡蛋白提取液有诱导细胞向多能干细胞转变的现象,因为多能 标志蛋白有意义地升高了。

 对比猪卵提取液和蟾蜍卵提取液,鸡蛋白提取液获取更方便,获取量更 大,提取过程注意无菌操作,获得的鸡蛋白提取液无须过滤除菌就可用于细 胞培养,有较大的应用价值。在我们以前的研究中,发现鸡蛋白提取液有促 细胞增殖的作用[4, 5],还有促进多能因子0CT4和NANOG升高表达的作用[6, 7] ,因此在本研究中我们进- - 步应用干细胞蛋白芯片检测更多的多能因子,同 时使用4种细胞,都检测到其中多能因子的升高表达,C57- BMSC有S0X17、BMPR- -1A和NANOG这3个蛋白发生了统计学意义的改变,TS-UC- MSC有BMPR- -1A蛋白发生了统计学意义的改变,293T有BMPR- 1A蛋白发生了统计学意义的改变,293T- GFP有0CT4蛋白发生了统计学意义的改变,进一步验证了鸡蛋白提取液有诱 导体细胞向多能细胞转变的作用。

 

由于C57-BMSC和TS-UC- MSC是间充质干细胞,它们经过诱导后多能因子进- -步升高表达,是否证明 了鸡蛋白提取液含有某些逆向分化细胞的特殊物质,以及这些物质的鉴定和 分离提取还有待实验进一步验证。

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