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L-丝氨酸的酶法合成及分析
2022-1-7

  

L-丝氨酸的酶法合成及分析

摘要:利用重组大肠杆菌表达丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT) 和 色氨酸酶(TPase), 并利用双酶法合成L-色氨酸。采用PCR 从大肠杆菌K12基因组中扩增上述两种酶的基因,利用pET- 28a载体,构建单表达重组质粒pET-SHMT、 pET-TPase 和共 表达重组质粒pET-ST。 将上述3种重组质粒转入大肠杆菌 BL21 (DE3)进行表达。SDS-PAGE 结果表明,单表达基因工程菌 BL21 (DE3) /pET-SHMT和BL21 (DE3) /pET-TPase分别在47 kDa (SHMT)和50 kDa (TPase) 处有蛋白表达带;共表达基因工程 菌BL21 (DE3)/pET-ST在上述两处均有蛋白表达带。与宿主菌 相比,单表达SHNT基因工程菌产酶活性提高了6.4 倍;单表. 达TPase基因工程菌产酶活性提高了8.4 倍;共表达SHMT 和TPase 基因工程菌产酶活性分别提高了6.1和6.9倍。利用工程菌所产酶进行双菌双酶法和单菌双酶法合成L-色氨酸。 两菌双酶合成L-色氨酸的累积量达到41.5 g/L,甘氨酸转化 率为83.3%,吲哚转化率为92. 5%;单菌双酶合成L-色氨酸. 的累积量达到28.9 g/L,甘氨酸转化率为82. 7%,吲哚转化 率为82. 9%。 关键词:丝氨酸羟甲基转移酶,色氨酸酶,串联表达,双酶法 合成

物性性质

 1.性状:有左旋体和消旋体两种,左旋体是白色六角棱柱状晶 体,味甜;消旋体是白色单斜棱柱状晶体。

 2.密度(g/mL, 25/4C) : 1.415

 3.相对蒸汽密度(g/mL, 空气=1) :未确定

 4.熔点(°C) : 223~228C (分解) 

5.溶解性:左旋体,溶于水,不溶于无水乙醇和乙醚;消旋体。 略溶于水,不溶于无色乙醇、乙醚。

.主要用途 1.作生化试剂和食品添加剂。 

2.营养增补剂,在化妆品中作为皮肤营养添加剂。

 3.可供生物化学和营养学研究之用,也可作为合成环丝氨酸的 原料。 原理 本项目主要研究丝氨酸羟甲基转移酶催化甘氨酸生成L-丝氨酸。 丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT) 在生物体内是由GlyA基因编码 的,此酶能在四氢叶酸(THF)、甲醛及磷酸吡哆醛5' -PLP存 在下,催化甘氨酸生成L-丝氨酸。其反应过程右图所示。

材料、试剂、仪器: 1、原料:细菌破碎上清液 2、主要试剂

甘氨酸、甲醛、四氢叶酸、氯化钠、葡萄糖、无水乙醇、氯化 钙、氢氧化钠 

3、主要仪器 电子天平,无菌超净工作台高速离心机、恒温培养箱 方法.

 1、甘氨酸浓度确定:在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集 的上清酶液100ml,加入甘氨酸至终浓度分别为6 mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、 12mmol/L 和14mmol/L,再加入 甲醛至终浓度10 mmol/L, 磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L,四 氢叶酸至终浓度5 mmol/L, 37°C,190rpm 摇床反应16h。反应 液进行L-丝氨酸浓度测定。.

 

2、甲醛浓度确定:在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的 上清酶液100ml,加入甲醛至终浓度分别为0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、 15 mmol/L 和20mmol/L,再加入甘氨酸至 终浓10mmol/L,磷酸吡哆醛至终浓度0. 5mmol/L,四氢叶酸至. 终浓度5 mmol/L, 37C,190rpm 摇床反应16h。反应液进行L- 丝氨酸浓度测定。

 3、磷酸吡哆醛浓度确定:在5个250ml三角瓶中分别加入上面 收集的上清酶液100ml,加入磷酸吡哆醛至终浓度分别为0 mmol/L、0.2 mmol/L、 0.5 mmol/L、0. 75 mmol/L 和1mmol/L,

再加入甘氨酸至终浓度10 mmol/L, 甲醛至终浓度10mmol/L, 四氢叶酸至终浓度5 mmol/L, 37C,190rpm 摇床反应16h。反. 应液进行L-丝氨酸浓度测定。 

4、pH确定:在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集的上清 酶液100ml,加入甘氨酸至终浓度为10 mmol/L, 再加入甲醛至 终浓度10 mmol/L, 磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L,四氢叶酸 至终浓度5 mmol/L,并调节不同的pH为 6.0,7.0,8. 0,9.0, 10.0,37°C,190rpm 摇床反应16h。反应液 进行L-丝氨酸浓度测定。

5、 反应时间确定

      :在5个250ml三角瓶中分别加入上面收集 的上清酶液100ml,加入甘氨酸至终浓度为10 mmol/L, 再加入 甲醛至终浓度10 mmol/L, 磷酸吡哆醛至终浓度0. 5mmol/L,四 氢叶酸至终浓度5 mmol/L, 37°C,190rpm 摇床反应时间分别为 Oh, 8h, 16h, 24h, 36h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。丝氨酸 的分离与分析检测

丝氨酸的分离与分析检测原理

 

     薄层层析是一种微量而快速的层离方法。这种层析方法是把吸 附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板上(玻璃或金属等)形成薄 层,把要分析的样品溶液滴加到薄层的- -端,然后在此薄层上 用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。本实验中硅胶作为一种 固相支持物,它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在硅胶上的水是固定相,而展层溶剂是流动相。当 欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时, 它们就能被分离开。

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